lncrna引物设计（lncRNA的招数剖析）

引言

非编号RNA (ncRNA) 参加表观遗传管控，但掌握很少。在这儿，我们在11个解剖学位置以五个碱基对屏幕分辨率叙述了4个人们HOX基因座的基因表达园林景观特点，并评定出231个HOX ncRNAs, 他们将已经知道的基因表达地区拓宽超出 30 千碱基。HOX ncRNAs沿生长发育轴室内空间表述，有着与众不同的编码序列模体，其表述定义了差别组蛋白甲基化和RNA聚合酶普适性的普遍性染色体结构域。

科学研究結果

图1

图1：HOXA结构域的人们HOX转录组。

(A) 结构域非特异基因表达。左：5053两个探头的混种杂交抗压强度，这种探头对11个样版中的每一个样版的人 HOXA基因座开展拼凑（用圆形序号）。每一个探头的抗压强度表明为单独探头抗压强度的比率除于列阵上全部301,027个探头的均值抗压强度的log2每一个探头的 log2比例取100 bp对话框的均值；红色和绿色条各自表明高过或小于列阵均值。蛋白质编号HOX遗传基因的基因部位表明为深棕色框。右：11 个纤维细胞样版有关生长发育轴的人体解剖学来源于。

(B) 基因表达地区根据地砖列阵上的持续数据信号鉴别，随后与 Refseq 编码序列较为以明确遗传基因 [外显子（粉红色）和内含子（深蓝色）] 和遗传基因间基因表达地区（蓝紫色）。每一个预测分析的HOX外显子或内含子各自被取名为HOXn或int-HOXn。遗传基因间基因表达地区取名为 nchoxn，在其中n是HOX编码链上坐落于ncRNA 3′ 端 HOX paralog。

(C) 全部四个HOX基因座的基因表达地区小结，界定了 HOX 遗传基因、内含子和ncRNA基因表达地区的总数。

图2

图2：HOX ncRNA的结构域非特异表述和一级编码序列模体。

(A) HOX编号的转录本顺着近端-远侧轴差别表述。60个基因表达地区（12个HOX遗传基因和48 个 ncRNA）在远侧纤维细胞样版（脚部、手指头、包皮过长和男性前列腺）和全部别的体细胞中间差别表述（P < 0.05，Student t 检测）。以色彩平衡表明高过或小于整体中位值的每一个基因表达地区的表述水准（线形标尺上为3倍至0.3倍，或log2标尺上为 1.6 至-1.6 倍）。基因表达地区按其沿性染色体的部位排列，样版根据这60个换网录本的表述相似度开展分层次聚类算法。HOX的旁系亲属同源基因演变发源到翱翔超胸 (UBX) 或触须腹 (Antp) 各自用蓝色和黄色框架表明。

(B)HOX编号的转录本顺着前后左右解剖学系统分区差别表述。一共有92个转录本（6 个 HOX 遗传基因，86 个 ncRNA）在前或后原代纤维细胞塑造（脐上或脐下）中差别表述（P < 0.05，Student t 检测）。每一个 ncRNA 的表述如 (a) 所显示。

(C) 根据其表述方式，HOX ncRNA中聚集的编码序列基序 (p < 10-9)。ncRNAs 一级网编码序列中聚集的编码序列基序的Logograms超出非基因表达的HOX编码序列，或是在ncRNAs的远侧，近端，或后边的表述方式。在前侧解剖学位置表述的ncRNA沒有比预估大量的一级编码序列模体。

图3

图3：在HOXA基因座占有Suz12,H3K27me3, 和pol II与在原代肺（上）或足（下）纤维细胞 (Fb) 的 HOXA 基因座的 ~100 kb 基因表达特异性上彻底反过来的染色质装饰和基因表达可进入性。针对集成ic数据信息，集成ic/键入的 log2 比绘图在 Y 轴上。针对 RNA 数据信息，以线形占比表明混种杂交抗压强度。斜线突显染色质装饰和遗传基因间基因表达反过来构形的界限。

图4

图4：HOXC结构域反义基因间长ncRNA HOTAIR。

(A) HOTAIR在2个染色质结构域界限的基因部位。集成ic和RNA在拼凑列阵上的表述如图所示 3 所显示。

(B)链非特异RT-PCR表明HOXC遗传基因反过来链的 HOTAIR的唯一表述（底端）。设计方案逆转录 (P-RT)和PCR(P-PCR) 的引物设计，专业对于HOTAIR 的顶部（引物设计F1-F3）或底端链（引物设计R1）。

(C)肺和包皮过长纤维细胞RNA中暖空气的 Northern印痕剖析。

(D) 尺寸精彩片段小RNA用包括HOTAIR寡核苷酸池（1-3组），总长反义HOTAIR 或 miRNA let7a 探头检测。

(E) 用qrtpcr 检验HOTAIR在人纤维母细胞的后侧和远侧表述。每一份纤维细胞样版的来源于位置由解剖学可爱卡通上的样版序号表明。“A”来自头发。每一个部位相对性于头发（最前边）的暖风相对丰度表明在 X 轴上。

(F) 在试管胚胎10.5天全试管胚胎（图中）和后腿及尾端（左下面的图和右下面的图）中应用HOTAIR se网nse（底链）或antest（顶链）探头开展全试管胚胎原位杂交。HOTAIR在后腿（箭头符号）和尾端（箭头符号）的表述突显。

图5

图5：HOXD结构域H3K27三甲基化和Suz12团块必须 HOTAIR。

(A) HOXD基因座上H3K27me3 ChIP-ChIP数据信号的转变 是由HOTAIR的枯竭造成的，与对于GFP 的对比siRNA对比。HOXD遗传基因的部位用深棕色框表明。

(B) 靶向治疗GFP或HOTAIR的siRNA解决后，H3K27me3的ChIP和HOXD结构域可选择性启动子的 Suz12。底端：ChIP检验定量分析（均值标准误差）。

结果

我们在HOXC基因座中发觉了一个2.2千碱基的ncRNA，称之为 HOTAIR，它根据 HOXD 基因座的40千碱基抑止基因表达。HOTAIR与多梳抑止复合体2 (PRC2) 相互影响，是PRC2团块和HOXD 结构域组蛋白H3磷酸氢钙-27三甲基化所必不可少的。因而，ncRNA的基因表达很有可能在一定间距内定义了基因沉默的性染色体地区；这种結果对生长发育和病症情况下的遗传基因管控具备普遍的实际意义。

DOI：10.1016/j.cell.2007.05.022

论文参考文献

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